RT Audacity - шаблон joomla Оригами

مقالات منتخب

مروری بر تست های تشخیص سریع عوامل باکتریایی در بیوتروریسم(بخش دوم)

بیوتروریسمBioterrorism)) به معنی استفاده از عوامل پاتوژنیک و یا توکسین های بیولوژیک به عنوان سلاح در دستیابی به مقاصد نظامی، سیاسی و یا  ایدئولوژیک می باشد. استفاده از این نوع سلاح می تواند به وسیله دولت ها و یا گروه های مخاصم انجام بپذیرد. استفاده نظامی از عوامل بیولوژیک از سال های بسیار دور آغاز شده و تاکنون نیز ادامه یافته است. علی رغم تحریم های بین المللی از قبیل معاهده  1972 درخصوص منع استفاده از سلاح های بیولوژیک که توسط بیش از 140 کشور امضاء شد مدارکی وجود دارد که نشان دهنده استفاده از عوامل عفونی به عنوان سلاح بیولوژیک برای اهداف نظامی و بیوتروریستی می باشد. سلاح های بیو لوژیکی، ارگانیسم ها یا سموم  بیولوژیکی هستند که متأسفانه تهیه و عرضه آنها با توجه به پیشرفت تکنولوژی کار دشواری نیست و استفاده از آنها برای نیرو های مخاصم ایمن بوده و قادر به ناتوان سازی و یا نابودسازی افراد تحت حمله به روشی ساده و  قابل تکثیر و دائمی می باشد. تقریباً تمام باکتری ها و یا ویروس های پاتوژن پتانسیل استفاده به عنوان سلاح بیولوژیک را دارند اما به توجه به فیزیولوژی این ارگانیسم ها و میزان بیماری زایی و سهولت انتقال، تعدادی از آنها در الویت استفاده به عنوان سلاح میکروبی قرار می گیرند. سازمان کنترل بیماری ها(CDC ) برطبق میزان بیماری زایی و خطر آفرینی عوامل بیولوژیک برای سلامت فردی و سلامت عمومی جامعه ، آنها را در سه کلاس مجزا رده بندی کرده است که شامل کلاس های A ، B و Cمی باشند. کلاس A  شامل پاتوژن های با بیشترین میزان خطر آفرینی و کلاس C به نسبت دیگر کلاس ها از خطر کمتری برخوردار می باشد. امروزه پایش و عملکرد سریع در مقابله با سلاح های بیولوژیک از اهمیت بسیار زیادی برخوردار بوده که به ایجاد سیستم های پدافند زیستی انجامیده است. از جمله اقدامات ویژه در پدافند های زیستی به کار گرفتن روش های آزمایشگاهی تشخیص سریع عوامل بیولوژیک می باشد. از این رو در ادامه به چند مورد از روش های تشخیص سریع این عوامل که در سال های اخیر مورد تحقیق قرار گرفته اند اشاره می شود.

ویبریو کلورا(Vibrio Cholera)

ویبریو کلرا، یک باکتری باسیلی خمیده، گرم منفی و متحرک توسط تاژک بوده که در آب های آزاد و سطحی یافت می شود. ویبریو کلرا عامل بیماری شناخته شده وبا می باشد. این باکتری دارای آنتی ژن های Hتاژکی ناپایدار در برابر حرارت) و O(پلی ساکاریدی) بوده و نیز یک انتروتوکسین(CT) حساس به حرارت تولید  می کند که عامل اسهال در بیماری وبا می باشد. ویبریو کلرا شامل چند نژاد  آبزی می باشد که قابلیت ایجاد اپیدمی ها و پاندمی های بیماری  وبا را دارند. سویه های بیماری زا دارای ناحیه ژنی جزیره بیماری زایی (PAI) بوده در حالی که این ناحیه در سویه های غیر بیماری زا یافت نمی شوند. این ارگانیسم در رده  B از عوامل بیوتروریسم قرار دارد تصویر(۶)(1 و 14).

 

تصویر(۷): A: کشت باکتری ویبریو کلورا B: نمایی ازباکتری ویبریو کلورا

H.kochو همکارانش از روش Rapid- PCRجهت تشخیص ویبریوکلرا در غذا استفاده کردند. آنها بیان داشتند که از PCRجهت فزون سازی انتخابی توالی های درون اپران توکسین کلرای باکتریVibrio Cholerae O1استفاده کرده اند. آنها نمونه هایی از مواد غذایی شامل: صدف خوراکی، گوشت، میگو، و کاهو را توسط باکتری choleraeآلوده کرده و سپس آنها را هموژنایزه کرده و یا به وسیله آلکالین پپتون واتر شستشو دادند. یک دوره غنی سازی 8-6 ساعته نیز انجام گرفت. محدوده تشخیص کمتر از 1CFUبه ازای 10grاز ماده غذایی به وسیله فزون سازی PCRمحتوای خام سلول های لیز شده، به دست آمد. این روش به شدت سریع عمل کرده و احتیاج به جداسازی DNAاز نمونه های مختلف ماده غذایی را مرتفع می سازد.(15)

A.K.Hasanو همکارانش از یک کیت تشخیصی جهت تشخیص سریع Vibriocholerae O1استفاده کردند. و گزارش آنها حاکی از آزمایش و توسعه یک کیت جدید، سریع و عملکردی بر مبنای روش رنگ سنجی Immunodiagnostic، جهت تشخیص مستقیم باکتری cholerae O1در نمونه های کلینیکی بود. این کیت Cholera SMARTنام داشت. برخلاف شرایط روش های کشت که زمان بر بوده و چند روز کامل طول می کشد، کیت Ch.SMARTمی تواند مستقیماً در مدت زمان کمتر از 15 دقیقه حتی توسط افراد غیر متخصص جهت تشخیص باکتری cholera O1استفاده شود در حالی که به دستگاه ها و ابزارهای پیچیده آزمایشگاهی نیز احتیاجی پیدا نمی شود. تعداد 120 نمونه کلینیکی و محیطی سویه های باکتریایی شامل سروتایپ های V.cholerae O1و غیر O1از نمونه های به دست آمده از نواحی مختلف مورد آزمایش قرار گرفته و واکنش مثبت تنها در مورد سروتایپ V.cholerae O1مشاهده شد. همچنین نتایج تحقیقاتی در بنگلادش که از کیت Ch.SMARTاستفاده کرده بودند حاکی از اختصاصیت 100 % و حساسیت 96 % کیت در مقایسه با روش کلاسیک کشت باکتری می باشد. نتایج تحقیقاتی در مکزیک نشان داد که کیت Ch.SMARTدر سازش 100 % با تست کوآگولاسیون در آزمایش بر روی 108 نمونه مدفوعی می باشد(16).

D.V singhو همکارانش با استفاده از توسعه آزمایش Hexaplex PCRاقدام به تشخیص سریع ژن های تنظیمی و بیماری زایی  Vibrio Choleraeو Vibrio mimicusکردند. آنها بیان داشتند که، آزمایش Hexaplex PCRرا جهت تشخیص سریع ژن های تنظیمی و بیماری زایی برای زیر واحد A آنزیمی توکسین Cholerae(ctxA)، توکسین Zonula occludens(zot)، انتروتوکسین جانبی cholera(aceToxin-coregulased pilus(tcpA)، پروتئین غشاء خارجی(ompU) و پروتئین ToxR تنظیمی مرکزی (toxR)، در باکتری های V.choleraeو V.mimicusانجام دادند. این Hexaplex PCRدر غربالگری سویه های V.choleraeو V.mimicus، پاتوژنیک–توکسیژنیک و غیر پاتوژن – غیر توکسیژن موفق عمل کرد. این موفقیت هم در مورد سویه های کلینیکی و هم در مورد سویه های محیطی مشاهده شد.(17)

اشیرشیا کولیEscherichia Coli O157:H7 ) )

اشیرشیا کولی ، از گروه باکتری های انتروباکتر یاسه بوده، باسیل گرم منفی است و عموما فلور نرمال انسان می باشد. اشیرشیا کولی نوع O157:H7شایع ترین سروتایپ تولید کننده وروتوکسین در میان انتروهموراژیک ها(خونریزی دهنده های روده ای ) می باشد. E.c O157:H7یک خطر جهانی برای سلامت عمومی بوده و در بسیاری از کولیت های هموراژیک از عوامل عمده می باشد که برخی از آن ها به سندرم اورمی همولایتیک (HaemolyticUraemic Syndrome) (HUS) و مرگ بیمار می انجامد. شدت بیماری، عدم وجود درمان موثر و پتانسیل ایجاد شیوع های با وسعت زیاد لزوم تحقیق و دستیابی به روش های جدید شناسایی و مقابله با بیماری را موجه نموده است. این ارگانیسم در رده B از عوامل بیوتروریسم قرار داردتصویر(۸)(1 و 18).

تصویر(۸):  A: کشت باکتری اشیرشیا کولی O157:H7B: بیمار مبتلا به  HUS

E.Berkenpasو همکارانش اقدام به تشخیص سریع باکتریEscherichia coli O157:H7به وسیله دستگاه سنسورهای صوتی Langasite pure shear horizontal surfaceنمودند. به علت نرخ قابل توجه مرگ و میر ناشی از E.coli O157به سنسورهایی جهت تشخیص سریع باکتری در آب و مواد غذایی برای کاهش خطر آلودگی جمعیت های انسانی و حیوانی نیاز است. استفاده از دستگاه SH SAWسوار شده بر Langasite(LGS- SH SAW)  با زوایای اویلر در تشخیص مونتاژهای پروتئین های ماکرومولکولی، موفق بود. این دستگاه پایداری دمایی مناسب، سازگاری زیستی و فرسایش انرژی کمی را در محیط های مایع، نشان داد که باعث می شود جهت تشخیص باکتریایی مناسب باشد. در این تحقیق راه اندازی (Set UP) تست بیوسنسور با استفاده از یک سیستم تزریق جریان کم حجم، کنترل دمای پایدار و محاسبه فاز با تکرار بالا، به کار گرفته شده، تا بیوسنسورهای LGS SHجهت تشخیص باکتریایی معتبرسازی شوند. مسیرهایی تأخیری LGS SHبا آنتی IgGپلی کلونال خرگوش، مشتق شده و ساخته شدند. که به صورت انتخابی به E.coli O157: H7باند می شوند (در این مورد به سویه آزمایش غیر توکسیژنیک باند شد).

تصویر(۹): دیاگرام سنسور LGS- SH SAW

برای سنجش تأثیر اتصال غیر اختصاصی(کنترل منفی)، یک آنتی بادی علیه ترینیترو فنیل هپتان (TNP) به عنوان لایه ی اتصالی مورد استفاده قرار گرفت. باکتری E.coli آزمایشی، کشت داده شده و توسط فرمالدهید تثبیت (FIX) شد سپس توسط رنگcell-permeant nucleic acid رنگ آمیزی شده و در محلول PBS(فسفات بافر سالین) سوسپانسیون گشت و با سطوح حسی پوشش دار شده با آنتی بادی تماس داده شد. فاز ضریب انتقال با استفاده از آنالیز شبکه ای مورد بررسی قرار گرفت. پاسخ های فاز حدود  برای تشخیص E.coliدر مقایسه با  به علت اتصال غیر اختصاصی Anti-TNP محاسبه شد. اولویت 30:1برای اتصال E.coliبه لایهAnti-O157:H7در قیاس با لایه ی Anti-TNPتوسط روش میکروسکوپی فلورسنسی نیز مشاهده شد.(19)

Jothikumarو همکارانش با استفاده از آزمایش Multiplex Real-Time PCRاقدام به تشخیص سریع باکتری Escherichia coli O157: H7نمودند و بیان داشتند که آزمایش SYBR Green Light Cycler PCRبا استفاده از یک جفت برایمر منفرد می تواند به تشخیص همزمان ژن هایstx1و یا stx2باکتری E.coli O157 : H7بیانجامد. توالی مجزای ژن های توکسین شبه شیگا(shiga-like) برای به دست آوردن محصولات به ترتیب bp227 و یا bp224 ، فزون سازی شدند. این دو محصول توسط آنالیز منحنی نقطه ذوب، از هم متمایز شده و تشخیص داده شدند(20).

Zhu Pو همکارانش جهت تشخیص سریع باکتری Eschircherichia coli O157: H7از روش جداسازی ایمنومگنتیگ در ترکیب با روش ایمنواسی فلورسنس استفاده کردند. آنها بیان داشتند که روش های مرسوم و کلاسیک کشت باکتری زمان بر بوده و پاسخ ها همراه با ابهام هستند. ایمنواسی سریع نسبت به روش کشت کلاسیک جهت تشخیص نمونه های مثبت فرضی مناسب تر و مقدم تر است و دارای صرفه اقتصادی و زمانی می باشد. تکنیک جداسازی ایمنومگنتیک (EMS) به صورت رایج ، جهت تشخیص باکتری coli O157: H7E. در نمونه های غنی شده ی مواد غذایی و آب، استفاده می شود که نوعاً می تواند در ادامه روش کشت کلاسیک و آنالیزهای بیوشیمیایی صورت پذیرد. در این تحقیق یک روش جدید که تکنیک EMSرا با ایمنواسی فلورسنس ترکیب کرده مورد بررسی و توسعه قرار گرفت. به این روش (IMFA) Immunomagneticflurescence assayگفته می شود که برای تشخیص coli O157: H7E. کاربرد دارد.سلول باکتری coli O157: H7E. ابتدا توسط دانه های مغناطیسی پوشش دار شده با آنتی بادی anti-O157گرفته شده و سپس توسط آنتی بادی آشکار ساز فلورسنت که ایجاد کمپلکس ایمنو ساندویچ می کنند تشخیص داده شد. سپس این کمپلکس برای محاسبه شدت فلورسنت با دستگاه اسپکتروفلورومتر Signalyte™-IIاز هم گسسته شده وآزمایش برای ارزیابی خطی بودن و حساسیت روش نیز طرح ریزی و اجرا شد. ضریب های اتصال بیشتر از  98 % بوده،  به صورتی که توسط روش کشت و Real-Time PCRمقداری،در حالیکه غلظت سلول ها کمتر از cells/mL105بود تعیین شده است. ضریب اتصال در غلظت بالای سلول ها به علت محدودیت ظرفیت اتصالی دانه های مغناطیسی، کاهش می یابد. در غلظت های پایین سلول () شدت فلورسنس محلول Cy5جدا شده در سطح بالایی با غلظت سلول های باکتری coli O157: H7E. همبسته بود و ارتباط دارد.محدوده تشخیص برای آب  بود. آزمایش معمولاً ظرف 3 ساعت انجام شده و نسبت به دیگر روش ها که مدت زمانی نزدیک به 24 ساعت را احتیاج دارند مقرون به صرفه تر است.(21)

شیگلا(Shigella)

شیگلا، باکتری گرم منفی میله ای نازک و دراز، بی هوازی اختیاری بوده که کلونی های محدب حلقوی و شفاف ایجاد می کند. شیگلا ها، الگوی آنتی ژنی پیچیده ای دارند اما انواع بیماری زای آن شامل : دیسانتری(A)، فلکسنری(‌‌‌B)، بویدی(C) و سونئی(D) می شود که در این میان شیگلا دیسانتری بیماری زایی بیشتری نسبت به دیگر گونه ها داشته و عامل مهمی در بیوتروریسم محسوب می شود. شیگلا دیسانتری را با نام باسیل شیگلا نیز می شناسند که نوعی اگزوتوکسین مقاوم به حرارت تولید می کند که بر روده و سیستم اعصاب مرکزی اثر می گذارد. این اگزوتوکسین پروتئینی با خاصیت آنتی ژنی ایجادکننده اسهال و در موارد حادتر ایجاد مننژیسموس و اغما می کند. مقاومت جدید آنتی بیوتیکی باعث ایجاد نگرانی در مورد این باکتری ها شده است. این ارگانیسم در رده B از عوامل بیوتروریسم قرار دارد(1 و22).

تصویر(۱۰): نمای میکروسکوپی از باکتری شیگلا دیسانتری

Jimenezو همکارانش با استفاده از سنجش مولکولی سریع با حساسیت افزایش یافته به تشخیص شیگلا در کاهو، اقدام کردند. آنها بیان کردند که بازده و سرعت روش مولکولی هنگام مقایسه آن با روش های رایج کشت مشخص می شود. نمونه های کاهو توسط غلظت های مختلف( از  تا  ) باکتری Shigellaflexneriتلقیح شدند. DNAمستقیم از کاهوهای تلقیح شده با باکتری استخراج شده(direct-PCR) که بعد از یک مرحله غنی سازی(enrichment PCR) این کار صورت گرفت. محدوده تشخیص Multiplex PCR،  بوده و حساسیت تشخیصی و اختصاصیت تست دقیقاً 100 % بود. یک کنترل فزون سازی داخلی (IAC) به اندازه bp100 برای اجتناب از نتایج منفی کاذب استفاده شد. این روش نتایج را در یک الی دو روز به دست می دهد. در حالی که روش های مبنی بر کشت به پنج تا شش روز زمان احتیاج دارند. هر چند باید در نظر داشت که محدوده تشخیص روش کشت  بوده و حساسیت تشخیصی آن 53 % و نیز اختصاصیت تشخیصی آن 100 % می باشد. در این تحقیق از Multiplex- PCRبرای تشخیص ژن های بیماری زای ipaHو ialاستفاده شد و نتایج بر مؤثر بودن روش صحه می گذارد.(23)

Pengو همکارانش برای تشخیص سریع سویه های shigellaدر فاضلاب های محیطی از روشImmuno capture PCRبا پرایمرهای یونیورسال استفاده کردند. آنها روش Immuno capture PCRرا با پرایمرهای یونیورسال ترکیب کرده و توسعه دادند به طوری که این روش به صورت مؤثری حساسیت تست را افزایش داده و نه تنها برای تشخیص سریع سویه های shigellaمناسب است بلکه برای تشخیص دیگر پاتوژن ها نیز کاربرد دارد.(24)

Ojhaو همکارانش برای تشخیص و افتراق سویه های shigellaاز روش آزمایش Pentaplex PCRاستفاده کردند. تشخیص های آزمایشگاهی رایج برای سویه های shigellaپرزحمت و زمان بر بوده و حساسیت کمی دارند. از این رو، در این تحقیق یک روش آزمایشگاه مبنی بر تشخیص مولکولی که به صورت همزمان چهار ژن خاص را جهت تشخیص invCبرای جنس های Shigella، rfcبرای S.flexneri ، wbgZبرای S.sonneiو rfpBبرای S.dysenteriaeفزون سازی می کند.بعلاوه یک ژن کنترل داخلی(ompA) در یک واکنش مجزا برای معتبرسازی تشخیص و افتراق سویه های نتایج حاصل از آن اختصاصیت 100 % را نشان داد. حساسیت واکنش PCR، pg100 از DNAژنومیک ، × 5.4 ، و یا تقریباً CFU120به ازای هر واکنش آمیخته باکتری ها بود. حساسیت آزمون Pentaplex PCRدر ادامه پیش انکوباسیون نمونه های مدفوع در مایع گرم منفی بیشتر افزایش می یافت. مطالعات اولیه بر روی 30 نمونه اسهال آبکی به این نتیجه رسید که هیچ واکنش متقاطعی با سویه هایnon-shigella آزمایش شده وجود ندارد. تست Pentaplex PCRیک روش توانمند در ایجاد اطلاعات در مورد چهار ژن هدف که برای تشخیص جنس های shigellaو سه سویه ی این باکتری که عامل اغلب موارد شیگلوزیس هستند می باشد.(25)

Wangو همکارانش از روش PCRاختصاصی و سریع جهت تشخیص سویه های Shigellaدر نمونه های مشخص شده استفاده کردند. هدف از مطالعات آنها توسعه یک سیستم PCRاختصاصی و سریع برای تشخیص سویه های Shigellaدر نمونه ها بود. مجموعه ای از پرایمرهای ویژه ژن بیماری زایی (virF) ، سویه ی بیماری زای Shigellaو E.coliکاملاً مهاجم (EIEC)، آمپلیکون های(محصولات فزون سازی شده) ویژه ای از سایزهای مورد انتظار bp443 و bp331 تولید کردند. که در این راستا از پرایمرهای VirF2-VirF3و VirF3-VirF4استفاده شد. این پرایمرها سپس برای تشخیص  از سویه های Shigellaتلقیح شده در نمونه غذایی در ادامه انکوباسیون مایع Shigellaاستفاده شدند و حضور این میکروارگانیسم در نمونه هایی که به صورت آزمایشی تلقیح شده بودند، تشخیص داده شد. در نهایت از این روش برای تشخیص 100 نمونه استفاده شد. و معلوم شد که هیچ یک از سویه های Shigellaو نژادهای باکتریای EIECدر نمونه های آزمایش شده توسط روش PCRو BAM(آنالیز باکتریولوژیکال Manu) تشخیص داده نشدند. نتایج مشخص کرد که روش PCRتشریح داده شده دارای سرعت،  اختصاصیت و حساسیت بالا برای استفاده در نمونه های طبیعی می باشد.(26)

تهیه و تنظیم:

سجاد بابایی 1، امید منصوری زاوله 2، اردشیر عباسی*3 

  1. کارشناس ارشد میکروبیولوژی ، گروه میکروبیولوژی ، دانشکده علوم پایه ، دانشگاه علوم تحقیقات واحد کردستان ، ایران
  2. کارشناس ارشد بیوشیمی ، گروه بیوشیمی ، دانشکده علوم پایه ، دانشگاه علوم تحقیقات  واحد کردستان ، ایران
  3. دانشجوی دکتری  ایمنی شناسی ، گروه ایمنی شناسی ، دانشکده پزشکی ، دانشگاه تربیت مدرس ، ایران

نویسنده مسئول :دانشجوی دکتری  ایمنی شناسی ، گروه ایمنی شناسی ، دانشکده پزشکی ، دانشگاه تربیت مدرس ، ایران

 

این مقاله در شماره 94 نشریه پیام آزمایشگاه به چاپ رسیده است.

References

  1. Morton N . Swartz MD. Recognition and management of Anthrax – An update. N Engl J Med, .( 2001). Vol. 345, No. 22.
  2. RongzhangHao, DianbingWang , Xian’en Zhang, GuominZuo, HongpingWei , Ruifu Yang, Zhiping Zhang,, Zhenxing Cheng, YongchaoGuo, Zongqiang Cui, Yafeng Zhou. Rapid detection of Bacillus anthracis using monoclonal antibody functionalizedQCM sensor, Biosensors and Bioelectronics 24 (2009) 1330–1335.
  3. Pierre N. Floriano, Nick Christodoulides, Dwight Romanovicz, Bruce Bernard, Glennon W. Simmons, Myles Cavell, John T. McDevitta, Membrane-based on-line optical analysis systemfor rapid detection of bacteria and spores, Biosensors and Bioelectronics 20 (2005) 2079–2088
  4. Janzen TW, Thomas MC, Goji N, Shields MJ, Hahn KR, Amoako KK. Rapid detection method for Bacillus anthracis using a combination of multiplexed real-time PCR and pyrosequencing and its application for food biodefense. J Food Prot. (2015) Feb;78(2):355-61.
  5. Amoako , Timothy W. Janzen, Michael J. Shields, Kristen R. Hahn, Matthew C. Thomas, Noriko Goji , Rapid detection and identification of Bacillus anthracis in food using pyrosequencing technology,  International Journal of Food Microbiology 165 (2013) 319–325.
  6. Léonid M. Irenge& Jean-Luc Gala, Rapid detection methods for Bacillus anthracis in environmental samples: ApplMicrobiolBiotechnol (2012) 93:1411–1422.
  7. Victor R. Rivera , Frank J. Gamez , William K. Keener , Jill A. White , Mark A. Poli. Rapid detection of Clostridium botulinum toxins A, B, E, and F in clinical samples, selected food matrices, and buffer using paramagnetic bead-based electrochemiluminescence detection.Analytical Biochemistry 353 (2006) 248–256.
  8. Shashi K. Sharma, Joseph. L. Ferreira,Brian S. Eblen,and Richard C. Whiting, Detection of Type A, B, E, and F Clostridium botulinum Neurotoxinsin Foods by Using an Amplified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with Digoxigenin-Labeled Antibodies, Applied And Environmental Microbiology, Feb. (2006), p. 1231–1238
  9. Mark Achtman*†, Kerstin Zurth*, Giovanna Morelli , et al.Yersinia pestis, the cause of plague, is a recentlyemerged clone of Yersinia pseudotuberculosis.Proc. Natl. Acad. Sci.( USA 96, 14043–14048.
  10. Caroline Loïez,Ste´phanieHerwegh,Fre´de´ric Wallet,Sylvie Armand,Franc¸´. Detection of Yersinia pestisin Sputum by Real-Time PCR. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Oct. (2003), p. 4873–4875.
  11. Zhongqiang Yan, Lei Zhou, Yongkai Zhao, Jing Wang, Lihua Huang, Kongxin Hu, Haihong Liu, Hong Wang, Hong Wang, Hong Wang, ZhaobiaoGuo, Yajun Song, Huijie Huang, Ruifu Yanga, Rapid quantitative detection of Yersinia pestisby lateral-flow immunoassay and up-converting phosphor technology-based biosensor. /j.snb(.2006).01.029
  12. David K. R. Karaolis*†, Judith A. Johnson‡§, Camella C. Bailey, et al.A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemicand pandemic strains.Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1998.(
  13. Walter H. Koch, William L. Payne, Barry A. Wentz, And Thomas A. Cebula, Rapid PolymeraseChain Reaction Method For Detection OfvibrioCholerae In Foods, Applied And Environmental Microbiology, Feb.(1993), P. 556-560
  14. Jafrul A. K. Hasan, AnwarulHuq, Mark L. Tamplin, Ronald J. Siebeling,AndRita R. Colwell.A Novel Kit For Rapid Detection Of Vibrio Cholerae 01. Journal Of Clinical Microbiology, Jan. (1994), P. 249-252
  15. , Development of a Hexaplex PCR Assay for Rapid Detection of Virulence and Regulatory Genes in Vibrio cholera and Vibrio mimicus.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Nov.(2002), p. 4321–4324.
  16. Nicole T. Perna*², Guy Plunkett , Valerie Burland, et al.Genome sequence ofenterohaemorrhagicEscherichia coli O157:H7.NATURE..VOL 409. 25.
  17. Detection of Escherichia coli O157:H7 with langasite pure shear horizontal surface acoustic wave sensors, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2255–2262
  18. Narayanan Jothikumar and Mansel W. Griffiths. Rapid Detection of Escherichia coli O157:H7 with Multiplex Real-Time PCR Assays, Applied And Environmental Microbiology, June (2002), p. 3169–3171
  19. Zhu P, Shelton DR, Li S, Adams DL, Karns JS, Amstutz P, Tang CM, .Detection of E. coli O157:H7 by immunomagnetic separation coupled with fluorescence immunoassay. BiosensBioelectron. (2011) Dec 15;30(1):337-41.
  20. Yiu-Wai Chu,1 Elizabeth T. S. Houang,1 Donald J. Lyon ,et al.Antimicrobial Resistance in Shigellaflexneri and Shigellasonneiin Hong Kong, 1986 to 1995.Antimicrobial Agents And Chemotherapy .(1998), p. 440–443.
  21. Kenia Barrantes Jiménez, Clyde B. McCoy, Rosario Achí., DETECTION OF Shigella In Lettuce By The Use Of A Rapid Molecular Assay With Increased Sensitivity, Brazilian Journal of Microbiology (2010) 41: 993-1000.
  22. XuanxianPeng,,Wen Luo, Jianying Zhang, Sanying Wang, and Shengcai Lin, Rapid Detection of Shigella Species in Environmental Sewage by an Immunocapture PCR with Universal Primers. APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May (2002), p. 2580–2583.
  23. Suvash Chandra Ojha,1Chan Yean Yean,Asma Ismail,and Kirnpal-Kaur Banga Singh,  A Pentaplex PCR Assay for the Detection and Differentiation ofShigella Species, BioMed Research International Volume (2013), Article ID 412370, 9 pages
  24. Shu-Jen Wang AndJiau Haw Chen, A Rapid and Specific PCR Method for the Detection ofShigella spp. in Spiked Samples, Journal of Food and Drug Analysis, Vol. 20, No. 1, (2012), Pages 59-65.

مروری بر روش های تشخیصی آزمایشگاهی لیشمانیوز جلدی و احشایی

 

 ليشمانيوز بیماری انگلي ناشي از گونه هايی از جنس ليشمانيا مي باشد که به اشکال پوستي(سالک)، مخاطي-پوستي(اسپونديا) و احشائي(کالاآزار) مشاهده مي گردند. انتقال بیماری از طریق گزش پشه خاكی ماده آلوده اتفاق می افتد. ليشمانيوزاحشائي مرگ و مير بالایی داشته، اما معمولاً بیماری سالک بدون مرگ و میر بوده ولي ضايعات بد شكل پوستي آن، در برخي موارد تا بيش از يكسال باقي مي مانند و معمولا ايجاد اسکار نموده که گاها بعد از درمان تا آخر عمر بر روی بدن باقی می ماند.

تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز جلدی

۱) روش تهیه گسترش مستقیم: بهتر است از بیمارانی که دارای ضایعات جلدی هستند سه نمونه  از نقاط مختلف ضایعه تهیه گردد آنهایی که دارای چند ضایعه هستند چند نمونه اخذ گردد. در صورت منفی بودن یک نمونه، نمونه های بعدی آزمایش می شود و اگر نمونه ی اولی مثبت شد نیازی به آزمایش نمونه های دوم یا سوم نیست. محل نمونه گیری باید لبه های ملتهب زخم باشد چون در آن نواحی بیشترین تراکم آماستیگوت وجود دارند. محل ضایعه را با استفاده از الکل ۷۰ درصد استریل کرده و شستشو داد.

ادامه مطلب...

مروری بر صحه‏ گذاری روش ‏های آزمایشگاهی / آزمون خطی بودن یا محدوده قابل گزارش

 

استفاده از يک روش يا کيت جديد در آزمايشگاه امری عادی و روزمره است و از آنجائی که یکی از عوامل موثر در روش آزمایشگاهی، استفاده از کیت جدید و یا تغییر شماره ساخت کیت می باشد، لذا ضروری است ادعای شرکت سازنده پیش از استفاده در آزمایشگاه مورد تصدیق قرار گیرد.
صحه گذاری روش های آزمایشگاهی، فرآیند استانداردی است که لزوماً برای هر آزمایشگاه و یا برای هر متدی، یکسان نبوده و هدف آن ارزیابی خطا در آزمایشگاه است. بر اساس الزامات CLIA، هر آزمایشگاه در ایالات متحده آمریکا ملزم است پیش از گزارش نتایج بیماران، خصوصیات عملیاتی خود شامل صحت، دقت، دامنه گزارش نتایج بیماران را بدست آورده و آن ها را با ادعای شرکت سازنده مقایسه نماید. همچنین لازم است هر آزمایشگاهی دامنه مرجع شرکت سازنده را برای جمعیت بیماران مراجعه کننده به آن آزمایشگاه تایید نماید. حساسیت و ویژگی آنالیتیکال نیز برای آن دسته از روش های اصلاح شده یا روش های پیچیده ضروری است.
رویکرد صحه گذاری روش های آزمایشگاهی، طراحی یکسری آزمایش جهت برآورد انواع خاصی از خطاهای آزمایشگاهی و خطاهای آنالیتیکال است. آزمایش هایی نظیر آزمون خطی بودن برای تعیین دامنه قابل گزارش، آزمون تکرارپذیری برای محاسبه میزان عدم دقت یا خطای تصادفی، آزمون مقایسه روش ها برای تخمین عدم صحت یا خطای سیستماتیک(خطای نظام مند)، آزمون تداخل و ریکاوری برای تعیین خطاهای سیستماتیک نسبی و ثابت(ویژگی آنالیتیکال) و آزمون حد آشکارسازی برای مشخص کردن حساسیت آنالیتیکال.
در این مجموعه سعی شده است تا با مرور بر مستندات پیش کسوتان علم آمار و آزمایشگاه بتوانیم با ساده ترین روش ها بر گسترده ترین معانی و مفاهیم آماری دست یابیم که این امر مستلزم همراهی گام به گام علاقمندان با این مجموعه است.


هدف
شرکت های سازنده، محدوده قابل گزارش ادعا شده خود را با تعیین محدوده های پایینی و بالایی مشخص می سازند و بسیار مهم است این ادعا توسط هر آزمایشگاهی تایید گردد. خصوصاً با فرض این که روش مورد نظر، خطی بوده و بر اساس کالیبراسیون دو نقطه ای کالیبر شده است.

تعاریف
کالیبراسیون: کالیبراسیون روشی است برای ایجاد ارتباط بین سیگنال تولید شده توسط دستگاه و غلظت آنالیت موجود در نمونه و سازنده کیت ملزم به فراهم کردن موادی برای کالیبراسیون روش خود می باشد.
در دستگاه های خودکار، بطور متداول، از کالیبراسیون دو نقطه ای استفاده می شود. در کالیبراسیون دو نقطه ای، بطور معمول، یک کالیبراتور، نقطه صفر و دیگری نقطه تنظیم را مشخص می کند(شکل 1). فرض بر این است که می توان خطی بین دو نقطه صفر و نقطه تنظیم کشید و امتداد داد، اما تا کجا؟
- جواب این سوال در گروتعیین محدوده قابل گزارش است.

کالیبراسیون چند نقطه ای: این کالیبراسیون برای روش هایی که پاسخ خطی تولید نمی کنند بکار برده شده(نظیر روش های ایمونواسی که معمولاًبا ۳ الی ۵ کالیبراتور درگیر هستند) و از برازش منحنی برای استقرار عملیات کالیبراسیون استفاده می گردد( شکل ۲).

- برخی قواعد ممکن است برای تعیین محدوده بالایی و محدوده قابل گزارش لازم باشند، حتی زمانی که در محدوده بالایی، کالیبراتور با غلظت بالا وجود دارد.

 

آزمونی که باید اجرا شود بنام آزمون خطی است که از لحاظ فنی لزومی ندارد روش مورد استفاده، پاسخ خطی را فراهم آورد مگر آنکه از کالیبراسیون دو نقطه ای استفاده کرده باشد.

تایید کالیبراسیون
تایید کالیبراسیون به معنی سنجش موادی با غلظت مشخص و با استفاده از روش بکار رفته برای نمونه بیماران است تا کالیبراسیون سیستم یا دستگاه، در سرتاسر محدوده قابل گزارش، اثبات گردد.
دامنه قابل گزارش: به معنی طیفی از مقادیر نتایج آزمایش است که در آن طیف، آزمایشگاه بتواند صحت دستگاه یا سنجش سیستم خود را تایید و استقرار دهد.
دانشکده پاتولوژیستان آمریکا از دو عبارت مختلف دیگر استفاده می کند:


۱. دامنه اندازه گیری آنالیتیکال: عبارتست از دامنه ای از مقادیر آنالیت که یک روش می تواند مستقیماً روی یک نمونه بدون تغلیظ یا رقت اندازه گیری نماید.
۲. دامنه قابل گزارش بالینی: عبارتست از دامنه ای از مقادیر آنالیت که یک روش با رقیق سازی یا تغلیظ یا هر روش دیگری می تواند برای توسعه دامنه اندازه گیری آنالیتیکال اندازه گیری نماید.

فاکتورهای قابل ملاحظه
انجام آزمون خطی بودن مستلزم داشتن مجموعه ای از نمونه ها با غلظت مشخص(شکل ۳) یا مجموعه ای از رقت های مشخص از یک نمونه با غلظت بالاست(شکل ۴).
مقادیر اندازه گیری شده(بر روی محور y ها) در مقابل مقادیر مشخص(بر روی محور X ها)، بر روی نمودار مقایسه می گردند. دامنه قابل گزارش بوسیله بررسی نمودار خطی ارزیابی می شود.
رسم نمودار خط با داده های بدست آمده از آزمون خطی بودن با استفاده از کامپیوتر بوسیله آماره رگرسیون خطی تحت عنوان "بهترین تناسب "و یا بصورت دستی به نام "تناسب بصری " ترسیم می گردد و آن بهترین خطی است که کمترین نقاط بدست آمده در آزمون راهم در بر می گیرد.

 

تعداد سطوح غلظتی
CLSI حداقل 4 و ترجیحاً 5 سطح غلظتی مختلف را توصیه می کند. بیشتر از 5 سطح غلظتی هم می تواند استفاده شود بخصوص اگر لازم باشد حد بالایی دامنه قابل گزارش به ماکزیمم برسد.

مواد
برای اجرای آزمون خطی بودن ، برحسب آزمایش مورد نظر، می توان از مواد مختلفی استفاده نمود. بطوری که محلول های استاندارد، نمونه های با مقادیر مشخص یا نسبت های معین از مواد که توسط سازندگان و تامین کنندگان آزمون مهارت فراهم گشته اند، رقت های مختلف از نمونه های بیمار و نمونه های جمع آوری شده از بیماران می تواند برای اجرای این آزمون مورد استفاده قرار گیرند. برای آزمون " پایش دارو درمانی "، لازم است داروی مورد نظر به سرم جمع آوری شده اضافه گردد.
در صورتی که مقادیر بالا در دسترس اند، ممکن است رقت هایی از نمونه های بیمار مورد استفاده قرار گیرند که اغلب برای این آزمون، مناسب و مقرون به صرفه هستند.

رقیق کننده های مناسب برای استفاده از نمونه بیمار
برای حفظ ماتریکس نمونه مدّ نظر، لازم است رقیق کننده مناسب انتخاب گردد؛ یعنی اگر نوع نمونه، سرم است حفظ ماتریکس سرمی برای سری نمونه های رقیق شده حائز اهمیت است.
برای آزمایشات متداول شیمی بالینی، آب و سرم فیزیولوژی مورد قبول اند و برای آزمایشات دیگر بهتر است از سرم آلبومین یا سرم گاوی آماده و یا نمونه هایی با غلظت کم یا سرم عاری از دارو استفاده نمود.
راه آلترناتیو دیگر برای انتخاب رقیق کننده، پیروی از توصیه های شرکت سازنده است.

مراحل آماده سازی رقت ها
بهتر است از دو پولد سرم استفاده شود. یکی سطح نزدیک به صفر یا نزدیک به محدوده آشکارسازی و دیگری نزدیک یا کمی بالاتر از محدوده بالایی دامنه قابل گزارش .
- مشخص نمودن "پولد پایین " بصورت 1POOL و "پولد بالا "بصورت 5POOL
- آماده سازی "پولد 2" با سه قسمت از 1POOL و یک قسمت از 5POOL
- آماده سازی "پولد 3" با دو قسمت از 1POOL و دو قسمت از 5POOL
- آماده سازی "پولد 4" با یک قسمت از 1POOL و سه قسمت از 5POOL
اگر سطوح بیشتری مورد نیاز باشد، تقسیم بندی فوق می تواند تغییر داده شود؛ مثلا 4 به 1، 3 به 2، 2 به 3 و 1 به 4 که به همراه دو سطح بالایی و پایینی مجموعاً 6 سطح خواهد شد.

تعداد تکرار اندازه گیری ها
CLSI توصیه می کند که برای هر نمونه 4 بار اندازه گیری صورت پذیرد ولی بطور کلی 3 تکرار کافی است.

تحلیل داده ها
میانگین مقادیر اندازه گیری شده را بر روی محور Y و مقادیر متناسب با فاکتورهای رقتی را روی محور X رسم کنید. در سراسر دامنه آنالیتیکال، خط را نقطه به نقطه، رسم کنید. بصورت دستی، رسم بهترین خط مستقیم با عبور از میان بیشترین نقاط صورت می گیرد. در غلظت هایی که خط مستقیم مماس بر نقاط نمی گذرد، لازم است خطای سیستماتیک مربوط به غیر خطی بودن را ارزیابی نمایید.
و در آخر، مجموع خطای سیستماتیک و خطای تصادفی قابل انتظار را نسبت به خطای مجاز کلی مقایسه نمایید.

یک مثال کاربردی
اطلاعات ذیل در مورد کلسترول است :
نمونه با غلظت صفر : مقادیر قرائت شده در سه بارخوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: صفر و5 و10 با میانگین 5
نمونه با غلظت 100 : مقادیر قرائت شده در سه بارخوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 95 و100 و105 با میانگین 100
نمونه با غلظت 200 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 195 و200 و205 با میانگین 200
نمونه با غلظت 300 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 290 و300 و310 با میانگین 300
نمونه با غلظت 400 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 380و390 و400 با میانگین 390
نمونه با غلظت 500 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 470و460 و480 با میانگین 470

 

در شکل شماره ۵، خط توپر، از اتصال نقاط حاصل از آزمون بدست آمده است و خط منقطع خط مستقیمی است که از پایین ترین نقطه تا قسمت میانی کشیده شده و تا انتها امتداد یافته است. برای محاسبه خطای سیستماتیک از فرمول شماره ۱ استفاده می شود:


فرمول شماره ۱
مقدار قابل انتظار - مقدار مشاهده شده = خطای سیستماتیک
بر اساس فرمول فوق، میزان خطای سیستماتیک در غلظت mg/dl 400 برابر خواهد بود با :
mg/dl10=390-400
و به همین ترتیب میزان خطای سیستماتیک در نقطه mg/dl 500 برابر خواهد بود با:
mg/dl 30 =470-500
محدوده قابل گزارش به روشنی تا mg/dl 300 گسترش یافته است. اما سوال آن است که آیا این محدوده می تواند تا غلظت mg/dl 400 یا 500 نیز گسترش یابد ؟
بر اساس معیار CLIA، عدم دقت مجاز کلسترول معادل 3% (CV%=3) است، بر اساس فرمول شماره ۲، در غلظت mg/dl 500، انحراف معیار(SD) این آنالیت برابر mg/dl 15 خواهد بود:

فرمول شماره ۲                                                

 

و بدین ترتیب 2SD که برآوردی از خطای تصادفی است برابر با mg/dl30 خواهد بود؛ این بدان معناست که خطای سیستماتیک غیرخطی می تواند سبب گردد یک نمونه با ارزش واقعی mg/dl500، بطورمتوسط mg/dl470 اندازه گیری شود. همچنین، به علت خطای تصادفی موجود در آزمون که به اندازه mg/dl30± است، مقدار قابل انتظار می تواند mg/dl 440 و یا mg/dl500 برای نمونه ای باشد که ارزش واقعی آن mg/dl500 است:

 بر اساس معیار CLIA، میزان خطای کلی مجاز کلسترول معادل ۱۰% است؛ یعنی میزان خطای کلی مجاز کلسترول در غلظت mg/dl 500 معادل mg/dl 50 (500× 10% = 50) می باشد. حال باید بررسی نمود میزان خطای کلی آزمایشگاه چقدر است و آیا کوچکتر از میزان خطای کلی مجاز می باشد؟ برای محاسبه خطای کلی آزمایشگاه از فرمول شماره ۳ استفاده می گردد:

 

فرمول شماره ۳  

 

از آنجائی که خطای کلی آزمایشگاه بیشتر از خطای کلی مجاز کلسترول(60>50) است، بنابراین محدوده قابل گزارش باید تا حدّی محدود گردد که از خطای کلی مجاز(در اینجا 50) بیشتر نشود؛ پس منطقه مربوط به mg/dl500 در محدوده قابل گزارش محسوب نمی گردد.
به همین ترتیب، بر اساس فرمول شماره ۲، در غلظت mg/dl400، انحراف معیار(SD) کلسترول برابر mg/dl 12 خواهد شد:
بدین ترتیب 2SD که برآوردی از خطای تصادفی است برابر با mg/dl24 خواهد بود و این بدان معناست که خطای سیستماتیک غیر خطی باعث شده است غلظت یک نمونه با ارزش واقعی mg/dl 400، بطور متوسط mg/dl390 اندازه گیری شود. همچنین به علّت وجود خطای تصادفی به اندازه mg/dl 24±، مقدار قابل انتظار می تواند بین mg/dl 414 و 366 برای نمونه ای باشد که ارزش واقعی آن mg/dl400 است.
بر اساس معیار CLIA میزان خطای کلی مجاز کلسترول در غلظت mg/dl 400 معادل mg/dl 40 است. حال باید میزان خطای کلی آزمایشگاه را در این غلظت با استفاده از فرمول شماره ۳ محاسبه نمائیم که برابر خواهد بود با:

TE 34 =24+10= (12×2) + (390 -400) = 

از آنجائی که خطای کلی محاسبه شده آزمایشگاه کمتر از خطای کلی مجاز کلسترول(34< 40) می باشد، بنابراین غلظت mg/dl400 در محدوده قابل گزارش محسوب می گردد.

محدوده قابل گزارش و تایید کالیبراسیون
بر اساس CLIA، تایید کالیبراسیون(calibration verification) به معنی سنجش موادی با غلظت معلوم و با همان روشی است که برای نمونه بیمار انجام می گیرد تا کالیبراسیون سیستم آزمایش یا دستگاه در سراسر محدوده های قابل گزارش برای نتایج آزمایش بیمار اثبات گردد.
برای سیستم هایی که به ندرت کالیبره می شوند، کالیبراسیون باید حداقل هر 6 ماه یک بار مورد تایید قرار گیرد و همچنین در صورت تغییر کامل معرف ها، تغییر قسمت های اساسی، تعمیر عمده دستگاه یا یک اشکال تصحیح نشده در کنترل کیفیت که باعث انحراف نتایج شده است، کالیبراسیون انجام می گیرد.
قوانین CLIA برای سنجش موادی نظیر نمونه های بیمار، نباید یک محدودیت برای طرح های تجربی محسوب گردد. استفاده از اندازه گیری های تکراری، اطلاعات بهتری درباره خطای سیستماتیک احتمالی مربوط به کالیبراسیون فراهم می سازد.
روش تحلیل داده ها، باید اختلاف بین مقادیر مشاهده شده و مقادیر تعیین شده را مشخص نماید. سپس این اختلاف با معیار های قابل قبول مقایسه گردد.
اگر اندازه گیری های تکراری انجام شود، میانگین مقادیرمحاسبه شده و در صورتی که اندازه گیری ها منفرد باشد، اختلاف ارزش مشاهده شده را به طور مستقیم با خطای مجاز(تعیین شده از سوی CLIA) مقایسه می نماییم.

نویسنده:

دکتر اعظم کارخانه، دکترای تخصصی بیوشیمی بالینی
دپارتمان بیوشیمی آزمایشگاه رفرانس سازمان تأمین اجتماعی- اداره کل درمان مستقیم

 

منابع:



1. US Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS). Medicare , Medicaid , and CLIA Programs : Laboratory Requirements Relating to quality Systems and Certain Personnel Qualifications. Final Rule. Fed Regist Jan 24 .2003;16:3640-3714
2. CAP Laboratory Accreditation Checklists. http://www.cap.org
3. The Linearity of Quantitative Measurement Procedures : A Statistical Approach. Clinical and Laboratory Standards Institue, Wayne, PA.2003
4. CMS State Operations Manual – Interpretative Guidelines : Appendix C. http://www.cms.hhs.govCLIA/03_Interpretive_Guidelines_for_Laboratories.asp

 

این مقاله در شماره  94 نشریه پیام آزمایشگاه به چاپ رسیده است.

مروری بر متغیرهای پره آنالیتیک تاثیر گذار در ارزیابی بیومارکرهای قلبی

بیومارکرهای قلبی

چکیده

در سال های اخیر نقش آزمایشگاه های پزشکی در تشخیص بیماری های قلبی به طور چشمگیری افزایش پیدا کرده است، همچنین امروزه در این زمینه تعداد زیادی بیومارکر قلبی-عروقی پیشنهاد شده است. برای جلوگیری از اشتباهات پزشکی در این حیطه، تکنسین ها و پزشکان می بایست به خوبی بر عوامل تاثیر گذار بر کیفیت نتایج آزمایشگاه آگاه باشند. نظر به اینکه متغیرهای پره آنالیتیک بیشترین تاثیر را در خطاهای آزمایشگاهی دارند، در این مقاله مهمترین عوامل پره آنالیتیک تاثیرگذار در ارزیابی بیومارکرهای قلبی، با تمرکز بر بیومارکرهای مهم این حیطه، که شامل تروپونین قلبی و پپتید دفع کننده سدیم می باشند، مورد بحث قرار می گیرد.

ادامه مطلب...