RT Audacity - шаблон joomla Оригами

23123

استفاده از يک روش يا کيت جديد در آزمايشگاه امری عادی و روزمره است و از آنجائیکه یکی از عوامل موثر در روش آزمایشگاهی، استفاده از کیت جدید و یا تغییر شماره ساخت کیت می باشد، لذا ضروری است ادعای شرکت سازنده پیش از استفاده در آزمایشگاه مورد تصدیق قرار گیرد.
صحه گذاری روش های آزمایشگاهی، فرآیند استانداردی است که لزوماً برای هر آزمایشگاه و یا برای هر متدی، یکسان نبوده و هدف آن ارزیابی خطا در آزمایشگاه است. بر اساس الزامات CLIA، هر آزمایشگاه در ایالات متحده آمریکا ملزم است پیش از گزارش نتایج بیماران، خصوصیات عملیاتی خود شامل صحت، دقت، دامنه گزارش نتایج بیماران را بدست آورده و آن ها را با ادعای شرکت سازنده مقایسه نماید. همچنین لازم است هر آزمایشگاهی دامنه مرجع شرکت سازنده را برای جمعیت بیماران مراجعه کننده به آن آزمایشگاه تایید نماید. حساسیت و ویژگی آنالیتیکال نیز برای آندسته از روش های اصلاح شده یا روش های پیچیده ضروری است.
رویکرد صحه گذاری روش های آزمایشگاهی، طراحی یکسری آزمایش جهت برآورد انواع خاصی از خطاهای آنالیتیکال است. آزمایش هایی نظیر آزمون خطی بودن برای تعیین دامنه قابل گزارش، آزمون تکرارپذیری برای محاسبه میزان عدم دقتیا خطای تصادفی، آزمون مقایسه روش ها برای تخمین عدم صحت یا خطای سیستماتیک ( خطای نظام مند)، آزمون تداخل و ریکاوری برای تعیین خطاهای سیستماتیک نسبی و ثابت (ویژگی آنالیتیکال) و آزمون حد آشکارسازی برای مشخص کردن حساسیت آنالیتیکال.
در این مجموعه سعی شده است تا با مرور بر مستندات پیش کسوتان علم آمار و آزمایشگاه بتوانیم با ساده ترین روش ها بر گسترده ترین معانی و مفاهیم آماری دست یابیم که این امر مستلزم همراهی گام به گام علاقمندان با این مجموعه است.

 

هدف:
شرکت های سازنده، محدوده قابل گزارش ادعا شده خود را با تعیین محدوده های پایینی و بالایی مشخص می سازند و بسیار مهم است این ادعا توسط هر آزمایشگاهی تایید گردد. خصوصاً با فرض این که روش مورد نظر، خطی بوده و بر اساس کالیبراسیون دو نقطه ای کالیبر شده است.

تعاریف
کالیبراسیون: کالیبراسیون روشی است برای ایجاد ارتباط بین سیگنال تولید شده توسط دستگاه و غلظت آنالیت موجود در نمونه و سازنده کیت ملزم به فراهم کردن موادی برای کالیبراسیون روش خود می باشد.
در دستگاه های خودکار، بطور متداول، از کالیبراسیون دو نقطه ای استفاده می شود. در کالیبراسیون دو نقطه ای، بطور معمول، یک کالیبراتور، نقطه صفر و دیگری نقطه تنظیم را مشخص می کند (شکل 1). فرض بر این است که می توان خطی بین دو نقطه صفر و نقطه تنظیم کشید و امتداد داد، اما تا کجا؟
- جواب این سوال در گروتعیین محدوده قابل گزارش است.

 - کالیبراسیون چند نقطه ای : این کالیبراسیون برای روش هایی که پاسخ خطی تولید نمی کنند بکار برده شده(نظیر روش های ایمونواسی که معمولاًبا ۳ الی ۵ کالیبراتور درگیر هستند) و از برازش منحنی برای استقرار عملیات کالیبراسیون استفاده میگردد( شکل ۲).

- برخی قواعد ممکن است برای تعیین محدوده بالایی و محدوده قابل گزارش لازم باشند، حتی زمانی که در محدوده بالایی، کالیبراتور با غلظت بالا وجود دارد.

 

آزمونی که باید اجرا شود بنام آزمون خطی است که از لحاظ فنی لزومی ندارد روش مورد استفاده، پاسخ خطی را فراهم آورد مگر آنکه از کالیبراسیون دو نقطه ای استفاده کرده باشد.

تایید کالیبراسیون :
تایید کالیبراسیون به معنی سنجش موادی با غلظت مشخص و با استفاده از روش بکار رفته برای نمونه بیماران است تا کالیبراسیون سیستم یا دستگاه، در سرتاسر محدوده قابل گزارش، اثبات گردد.
دامنه قابل گزارش:به معنی طیفی از مقادیر نتایج آزمایش است که در آن طیف، آزمایشگاه بتواند صحت دستگاه یا سنجش سیستم خود را تایید و استقرار دهد.
دانشکده پاتولوژیستان آمریکا از دو عبارت مختلف دیگر استفاده می کند:
۱. دامنه اندازه گیری آنالیتیکال : عبارتست از دامنه ای از مقادیر آنالیت که یک روش می تواند مستقیماً روی یک نمونه بدون تغلیظ یا رقت اندازه گیری نماید.
۲. دامنه قابل گزارش بالینی : عبارتست از دامنه ای از مقادیر آنالیت که یک روش با رقیق سازی یا تغلیظ یا هر روش دیگری می تواند برای توسعه دامنه اندازه گیری آنالیتیکال اندازه گیری نماید.

فاکتورهای قابل ملاحظه
انجام آزمون خطی بودن مستلزم داشتن مجموعه ای از نمونه ها با غلظت مشخص(شکل ۳) یا مجموعه ای از رقت های مشخص از یک نمونه با غلظت بالاست (شکل ۴).
مقادیر اندازه گیری شده (بر روی محور y ها) در مقابل مقادیر مشخص (بر روی محور X ها)، بر روی نمودار مقایسه می گردند. دامنه قابل گزارش بوسیله بررسی نمودار خطی ارزیابی می شود.
رسم نمودار خط با داده های بدست آمده از آزمون خطی بودن با استفاده از کامپیوتر بوسیله آماره رگرسیون خطی تحت عنوان "بهترین تناسب "و یا بصورت دستی به نام "تناسب بصری " ترسیم می گردد و آن بهترین خطی است که کمترین نقاط بدست آمده در آزمون راهم در بر می گیرد.

تعداد سطوح غلظتی
CLSI حداقل 4 و ترجیحاً 5 سطح غلظتی مختلف را توصیه می کند. بیشتر از 5 سطح غلظتی هم می تواند استفاده شود بخصوص اگر لازم باشد حد بالایی دامنه قابل گزارش به ماکزیمم برسد.

مواد
برای اجرای آزمون خطی بودن ، برحسب آزمایش مورد نظر، میتوان از مواد مختلفی استفاده نمود. بطوری که محلول های استاندارد، نمونه های با مقادیر مشخص یا نسبت های معین از مواد که توسط سازندگان و تامین کنندگان آزمون مهارت فراهم گشته اند، رقت های مختلف از نمونه های بیمار و نمونه های جمع آوری شده از بیماران می تواند برای اجرای این آزمون مورد استفاده قرار گیرند. برای آزمون " پایش دارو درمانی "، لازم است داروی مورد نظر به سرم جمع آوری شده اضافه گردد.
در صورتی که مقادیر بالا در دسترس اند، ممکن است رقت هایی از نمونه های بیمار مورد استفاده قرارگیرند که اغلب برای این آزمون، مناسب و مقرون به صرفه هستند.

رقیق کننده های مناسب برای استفاده از نمونه بیمار
برای حفظ ماتریکس نمونه مدّ نظر، لازم است رقیق کننده مناسب انتخاب گردد؛ یعنی اگر نوع نمونه، سرم است حفظ ماتریکس سرمی برای سری نمونه های رقیق شده حائز اهمیت است.
برای آزمایشات متداول شیمی بالینی، آب و سرم فیزیولوژی مورد قبول اند و برای آزمایشات دیگر بهتر است از سرم آلبومین یا سرم گاوی آماده و یا نمونه هایی با غلظت کم یا سرم عاری از دارو استفاده نمود.
راه آلترناتیو دیگر برای انتخاب رقیق کننده، پیروی از توصیه های شرکت سازنده است.

مراحل آماده سازی رقت ها
بهتر است از دو پولد سرم استفاده شود. یکی سطح نزدیک به صفر یا نزدیک به محدوده آشکارسازی و دیگری نزدیک یا کمی بالاتر از محدوده بالایی دامنه قابل گزارش .
- مشخص نمودن "پولد پایین " بصورت 1POOL و "پولد بالا "بصورت 5POOL
- آماده سازی "پولد 2" با سه قسمت از 1POOL و یک قسمت از 5POOL
- آماده سازی "پولد 3" با دو قسمت از 1POOL و دو قسمت از 5POOL
- آماده سازی "پولد 4" با یک قسمت از 1POOL و سه قسمت از 5POOL
اگر سطوح بیشتری مورد نیاز باشد، تقسیم بندی فوق می¬تواند تغییر داده شود؛ مثلا 4 به 1، 3 به 2، 2 به 3 و 1 به 4 که به همراه دو سطح بالایی و پایینی مجموعاً 6 سطح خواهد شد.

تعداد تکرار اندازه گیری ها
CLSI توصیه می کند که برای هر نمونه 4 بار اندازه گیری صورت پذیرد ولی بطور کلی 3 تکرار کافی است.

تحلیل داده ها
میانگین مقادیر اندازه گیری شده را بر روی محور Y و مقادیر متناسب با فاکتورهای رقتی را روی محور X رسم کنید. در سراسر دامنه آنالیتیکال، خط را نقطه به نقطه، رسم کنید. بصورت دستی، رسم بهترین خط مستقیم با عبور از میان بیشترین نقاط صورت می گیرد. در غلظت هایی که خط مستقیم مماس بر نقاط نمی گذرد، لازم است خطای سیستماتیک مربوط به غیر خطی بودن را ارزیابی نمایید.
و در آخر، مجموع خطای سیستماتیک و خطای تصادفی قابل انتظار را نسبت به خطای مجاز کلی مقایسه نمایید.

یک مثال کاربردی
اطلاعات ذیل در مورد کلسترول است :
نمونه با غلظت صفر : مقادیر قرائت شده در سه بارخوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: صفر و5 و10 با میانگین 5
نمونه با غلظت 100 : مقادیر قرائت شده در سه بارخوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 95 و100 و105 با میانگین 100
نمونه با غلظت 200 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 195 و200 و205 با میانگین 200
نمونه با غلظت 300 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 290 و300 و310 با میانگین 300
نمونه با غلظت 400 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 380و390 و400 با میانگین 390
نمونه با غلظت 500 : مقادیر قرائت شده در سه بار خوانش متوالی به ترتیب عبارتند از: 470و460 و480 با میانگین 470

در شکل شماره ۵، خط توپر، از اتصال نقاط حاصل از آزمون بدست آمده است و خط منقطع خط مستقیمی است که از پایین ترین نقطه تا قسمت میانی کشیده شده و تا انتها امتداد یافته است. برای محاسبه خطای سیستماتیک از فرمول شماره ۱ استفاده می-شود:


فرمول شماره ۱
مقدار قابل انتظار - مقدار مشاهده شده = خطای سیستماتیک
بر اساس فرمول فوق، میزان خطای سیستماتیک در غلظت mg/dl 400 برابر خواهد بود با :
mg/dl10=390-400
و به همین ترتیب میزان خطای سیستماتیک در نقطه mg/dl 500 برابر خواهد بود با:
mg/dl 30 =470-500
محدوده قابل گزارش به روشنی تا mg/dl 300 گسترش یافته است. اما سوال آن است که آیا این محدوده می تواند تا غلظت mg/dl 400 یا 500 نیز گسترش یابد ؟
بر اساس معیار CLIA، عدم دقت مجاز کلسترول معادل 3% (CV%=3) است،بر اساس فرمول شماره ۲، در غلظت mg/dl 500، انحراف معیار (SD) این آنالیت برابر mg/dl 15 خواهد بود:

 فرمول شماره ۲                                                

 

و بدین ترتیب 2SD که برآوردی از خطای تصادفی است برابر با mg/dl30 خواهد بود؛ این بدان معناست که خطای سیستماتیک غیرخطی می تواند سبب گردد یک نمونه با ارزش واقعی mg/dl500، بطورمتوسط mg/dl470 اندازه گیری شود. همچنین، به علت خطای تصادفی موجود در آزمون که به اندازه mg/dl30± است، مقدار قابل انتظار می تواند mg/dl 440 و یا mg/dl500 برای نمونه ای باشد که ارزش واقعی آن mg/dl500 است:

 بر اساس معیار CLIA، میزان خطای کلی مجاز کلسترول معادل ۱۰% است؛ یعنی میزان خطای کلی مجاز کلسترول در غلظت mg/dl 500 معادل mg/dl 50 (500× 10% = 50) می باشد. حال باید بررسی نمود میزان خطای کلی آزمایشگاه چقدر است و آیا کوچکتر از میزان خطای کلی مجاز می باشد؟ برای محاسبه خطای کلی آزمایشگاه از فرمول شماره ۳ استفاده می گردد:

فرمول شماره ۳  

 

از آنجائیکه خطای کلی آزمایشگاه بیشتر از خطای کلی مجاز کلسترول (60>50) است،بنابراین محدوده قابل گزارش باید تا حدّی محدود گردد که از خطای کلی مجاز (در اینجا 50) بیشتر نشود؛ پس منطقه مربوط به mg/dl500 در محدوده قابل گزارش محسوب نمی گردد.
به همین ترتیب، بر اساس فرمول شماره ۲، در غلظت mg/dl400، انحراف معیار (SD) کلسترول برابر mg/dl 12 خواهد شد:
بدین ترتیب 2SD که برآوردی از خطای تصادفی است برابر با mg/dl24 خواهد بود و این بدان معناست که خطای سیستماتیک غیر خطی باعث شده استغلظت یک نمونه با ارزش واقعی mg/dl 400، بطور متوسط mg/dl390 اندازه گیری شود. همچنین به علّت وجود خطای تصادفی به اندازه mg/dl 24±، مقدار قابل انتظار می تواند بین mg/dl 414 و 366 برای نمونه ای باشد که ارزش واقعی آن mg/dl400 است.
بر اساس معیار CLIA میزان خطای کلی مجاز کلسترول در غلظت mg/dl 400 معادل mg/dl 40 است. حال باید میزان خطای کلی آزمایشگاه را در این غلظت با استفاده از فرمول شماره ۳ محاسبه نمائیم که برابر خواهد بود با:

TE 34 =24+10= (12×2) + (390 -400) = 

از آنجائیکه خطای کلی محاسبه شده آزمایشگاه کمتر از خطای کلی مجاز کلسترول (34< 40) می باشد،بنابراین غلظت mg/dl400 در محدوده قابل گزارش محسوب می گردد.

محدوده قابل گزارش و تایید کالیبراسیون
بر اساس CLIA، تایید کالیبراسیون (calibration verification) به معنی سنجش موادی با غلظت معلوم و با همان روشی است که برای نمونه بیمار انجام می گیرد تا کالیبراسیون سیستم آزمایش یا دستگاه در سراسر محدوده های قابل گزارش برای نتایج آزمایش بیمار اثبات گردد.
برای سیستم هایی که به ندرت کالیبره می شوند، کالیبراسیون باید حداقل هر 6 ماه یک بار مورد تایید قرار گیرد و همچنین در صورت تغییر کامل معرف ها، تغییرقسمت های اساسی، تعمیر عمده دستگاه یا یک اشکال تصحیح نشده در کنترل کیفیت که باعث انحراف نتایج شده است، کالیبراسیون انجام می گیرد.
قوانین CLIA برای سنجش موادی نظیر نمونه های بیمار، نباید یک محدودیت برای طرح های تجربی محسوب گردد. استفاده از اندازه گیری های تکراری، اطلاعات بهتری درباره خطای سیستماتیک احتمالی مربوط به کالیبراسیون فراهم می سازد.
روش تحلیل داده ها، باید اختلاف بین مقادیر مشاهده شده و مقادیر تعیین شده را مشخص نماید. سپس این اختلاف با معیار های قابل قبول مقایسه گردد.
اگر اندازه گیری های تکراری انجام شود، میانگین مقادیرمحاسبه شده و در صورتی که اندازه گیری ها منفرد باشد، اختلاف ارزش مشاهده شده را به طور مستقیم با خطای مجاز (تعیین شده از سوی CLIA) مقایسه می نماییم.

نویسنده:

دکتر اعظم کارخانه، دکترای تخصصی بیوشیمی بالینی
دپارتمان بیوشیمی آزمایشگاه رفرانس سازمان تأمین اجتماعی- اداره کل درمان مستقیم


منابع
1. US Centers for Medicare & Medicaid Services (CMS). Medicare , Medicaid , and CLIA Programs : Laboratory Requirements Relating to quality Systems and Certain Personnel Qualifications. Final Rule. Fed Regist Jan 24 .2003;16:3640-3714
2. CAP Laboratory Accreditation Checklists. http://www.cap.org
3. The Linearity of Quantitative Measurement Procedures : A Statistical Approach. Clinical and Laboratory Standards Institue, Wayne, PA.2003
4. CMS State Operations Manual – Interpretative Guidelines : Appendix C. http://www.cms.hhs.govCLIA/03_Interpretive_Guidelines_for_Laboratories.asp