RT Audacity - шаблон joomla Оригами
Image is not available
Slider
Image is not available
Slider
111   312 23

مطالب علمی-پژوهشی

علمی-پژوهشی

  • 1
  • 2
  • 3

مروری بر روش های تشخیصی آزمایشگاهی لیشمانیوز جلدی و احشایی

 

 ليشمانيوز بیماری انگلي ناشي از گونه هايی از جنس ليشمانيا مي باشد که به اشکال پوستي(سالک)، مخاطي-پوستي(اسپونديا) و احشائي(کالاآزار) مشاهده مي گردند. انتقال بیماری از طریق گزش پشه خاكی ماده آلوده اتفاق می افتد. ليشمانيوزاحشائي مرگ و مير بالایی داشته، اما معمولاً بیماری سالک بدون مرگ و میر بوده ولي ضايعات بد شكل پوستي آن، در برخي موارد تا بيش از يكسال باقي مي مانند و معمولا ايجاد اسکار نموده که گاها بعد از درمان تا آخر عمر بر روی بدن باقی می ماند.

تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز جلدی

۱) روش تهیه گسترش مستقیم: بهتر است از بیمارانی که دارای ضایعات جلدی هستند سه نمونه  از نقاط مختلف ضایعه تهیه گردد آنهایی که دارای چند ضایعه هستند چند نمونه اخذ گردد. در صورت منفی بودن یک نمونه، نمونه های بعدی آزمایش می شود و اگر نمونه ی اولی مثبت شد نیازی به آزمایش نمونه های دوم یا سوم نیست. محل نمونه گیری باید لبه های ملتهب زخم باشد چون در آن نواحی بیشترین تراکم آماستیگوت وجود دارند. محل ضایعه را با استفاده از الکل ۷۰ درصد استریل کرده و شستشو داد.

سپس با استفاده از اسکالپل استريل، شكافي به عمق يك ميلي متر درمنطقه گرفته شده با انگشتان ايجاد کرد. از روش بیوپسی هم برای نمونه برداری استفاده می کنند و در نهایت از ترشحات حاصله بر روي لام گسترش تهيه شود و مشخصات بيمار با قلم الماس روي لام حك شود. لام توسط گیمسا رنگ آمیزی می شود. لام تهیه شده در زير ميكروسكوپ نوری مورد مطالعه قرار می گیرد، تشخيص مثبت، شامل ديدن انگل ليشمانيا( جسم لیشمن) بطور واضح مي باشد که بايد حداقل 30 شان مناسب که داراي سلول هاي ماکروفاژ باشد، بررسي گردد تا شانس مشاهده انگل بیشتر گردد. این اجسام ۲ الی ۴ میکرومتر بوده و گرد یا بیضی و معمولا در درون ماکروفاژها حضور دارند (شکل ۱)

 

شکل ۱- آماستیگوت لیشمانیا

 

۲)کشت انگل: محیط های کشت مناسب برای انگل لیشمانیاNovy-Mac Neal-Nicolle (NNN)، Evan’s Modified Tobie’s (EMTM)   وBrain–heart infusion (BHI) ، کشت RPMI1640 حاوی ۱۰ ٪ سرم جنین گاوی می باشند. تشخیص با این روش به ۳۰ الی ۵۰ روز زمان نیاز دارد که در صورت آلوده بودن می توان فرم پروماستیگوت انگل را مشاهده نمود( شکل ۲)

۳)تست پوستي ليشمانين(تست مونته نگرو) : پس از گذشت  48 تا 72 ساعت از تزريق ليشمانين، سفتی ایجاد شده با اندازه ۵ میلی متر به عنوان نتيجه مثبت تلقي مي گردد.

شکل ۲- پروماستیگوت لیشمانیا

۴) تزریق به حیوان حساس آزمایشگاهی: که روش تشخیصی مهمی نبوده و بیشتر در بررسی میزان عفونت زایی و همچنین در کارهای تحقیقاتی کاربرد دارد.

روش های آزمایشگاهی لیشمانیوز احشایی

۱) نمونه ‌برداري از ضايعات احشايي و انجام آزمايش هاي انگل شناسي 

نمونه برداری معمولا از ارگانهای طحال، مغز استخوان، كبد و غدد لنفاوي فرد بيمار انجام می شود. گسترش هاي تهيه ‌شده را ابتدا با متانول خالص به‌ مدت 5/0 تا 1 دقيقه ثابت کرده و سپس با رنگ گيمسا (10%) به‌ مدت 30 دقيقه رنگ‌آميزي مي‌ نمايند. سپس در زیر میکروسکوپ به جستجوی جسم لیشمن می پردازند. همچنین توصيه مي شود همراه با آزمايش مستقيم، کشت در محيط هاي اختصاصي خصوصا محيط NNN نيز صورت گیرد.

۲) روش هاي سرولوژي اختصاصي

از روش هاي مختلف سرولوژي براي جستجوي پادتن‌هاي اختصاصي بر عليه ليشمانيا استفاده می شود كه معمولاً از پروماستيگوت‌هاي کمپلكس ليشمانيا دونوواني خصوصا لیشمانیا اینفانتوم ، به‌ عنوان آنتي ژن استفاده مي شود.  از این روش ها می توان به روش های اگلوتیناسیون غیر مستقیم، ایمنوفلوئورسانس غیر مستقیم، کانترکارنت الکتروفورز، ژل دیفیوژن و ثبوت کمپلمان اشاره نمود.

روش ايمونوفلوئورسانس غيرمستقيم(Indirect Fluorescent Antibody)=IFA  : حساسيت و ويژگي اين تست حدود90% مي باشد. در سرم فرد مبتلا به ليشمانيوز احشايي آنتی بادی اختصاصي ايجاد مي‌شود و اين آنتی بادی با آنتی ژن ليشمانيا كه به‌ صورت دايره‌هايي به قطر يك سانتيمتر روي لام ميكروسكوپي قرارداده شده ‌است، مجموعه پادگن ‌ـ‌ پادتن ايجاد مي‌كند. در صورت افزودن پادتن ضدگلوبولين انساني كه با مادة فلوئورسين نشاندار شده است (كونژوگه)، مجموعة حاصله در زير نور ميكروسكوپ فلوئورسنت به رنگ سبز درخشان مشاهده مي  گردد.

روش  الايزاELISA  = (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay ): حساسيت اين روش بین 80 تا 100% است .اصول اين روش مشابه ايمونوفلوئورسانس غيرمستقيم است، با اين تفاوت كه از يك سيستم آنزيمي(آلكالن فسفاتاز و يا پراكسيداز) و سوبستراهاي اختصاصي استفاده مي‌‌گردد.

آزمايش آگلوتيناسيون مستقيمDAT =   (Direct Agglutination Test ): آزمايش آگلوتيناسيون مستقيم روشي ساده براي تشخيص ليشمانيوز احشايي بوده و حساسيت اين روش 100- 95 % و ويژگي آن 100- 86% تعیین گردیده است. در اين روش آنتی ژن در مجاورت رقت هاي گوناگون سرم يا پلاسماي فرد مشكوك به بيماري قرار داده مي‌شوند كه در صورت وجود آنتی بادی اختصاصي پديدة آگلوتيناسيون ايجاد مي‌شود. روش IFA بیشترین حساسیت و DAT بیشترین ویژگی را دارد.

آزمایش سریع سرولوژی با استفاده از استریپ های تهیه شده از آنتي‌ژن نوتركيب rK39: از محاسن اين روش‌ها سرعت انجام آزمايش است كه نتیجه آزمایش معمولاً در مدت حدود 2 تا 10 دقيقه مشخص می گردد.

۳) روش هاي سرولوژي غيراختصاصي

اين روش ها بر پاية افزايش ايمونوگلوبولين‌هاي سرم خون استوار است و به هر دليلي که ميزان پادتن در خون افزايش يابد، نتايج حاصل از اين روش ها مثبت خواهند شد، از مهمترین این روش ها می توان به آزمايش فرمل ـ ژل يا ناپيرآلدئيد اشاره کرد.

۴) روش هاي مولكولي

از روش هاي مولكولي خصوصاً PCR  براي تعيين گونة انگل هاي ليشمانيا استفاده مي‌شود. در سال هاي اخير از روش دهاي PCR،

PCR-ELISA PCR, Rapid fluorogenic ، RAPD-PCR و آنالیز Miicrosatellite براي تشخيص آزمايشگاهي ليشمانيوزها استفاده شده است .در حال حاضر روش هاي مولكولي براي تشخيص آزمايشگاهی ليشمانيوز بيشتر جنبه تحقیقاتی دارند.

نتیجه گیری

در لیشمانیوز احشایی، با توجه به مشابه بودن تظاهرت بیماری لیشمانیوز با سایر بیماری ها توصیه  می گردد علاوه بر آزمایشات مغز استخوان از نظر وجود اجسام لیشمن از سایر آزمایشات سرولوژی و PCR نیز برای اطمینان استفاده گردد. در لیشمانیوز جلدی هنوز آزمایش میکروسکوپی از اهمیت بسیاری برخوردار است در صورت منفی بودن میتوان از روش میکروکالچر استفاده کرد.

منابع

دکتر مهدی محبعلی"روش های تشخیص آزمایشگاهی لیشمانیوز ها در انسان" در کتاب انگل لیشمانیا و لیشمانیوزها تالیف دکتر ابوالحسن ندیم؛ دکتر عزت الدین جوادیان؛ دکتر مهدی محبعلی ؛ دکتر علی ضامن مومنی . انتشارات مرکز نشر دانشگاهی؛ تحریر سوم؛ سال 1387.

دکتر مهدی محبعلی"تاژکداران خون و نسج" در کتاب " تک یاخته شناسی پزشکی تالیف دکتر غلامحسین ادریسیان؛ دکتر مصطفی رضائیان؛ دکتر مهدی قربانی؛ دکتر حسین کشاورز و دکتر مهدی محبعلی. انتشارات دانشگاه علوم پزشکی تهران؛ چاپ اول؛ سال 1386.

تنظیم کنندگان: لعیا شمسي ، تراكمه سولماز ساماني

Nadim A, Mohebali M, Javadian I. Leishmania   and lishmaniasis. First ed, Tehran, Iran.

Swick B L. Polymerase chain reaction-based molecular diagnosis of cutaneous infections in dermatopathology. Semin Cutan Med Surg. 2012; 31(4): 241-246.

Galluzzo C, Eperon G, Mauris A, Chappuis F. Old World cutaneous leishmaniasis. Rev Med Suisse 2013; 9(385): 990-995.

Sinha R, Sehgal S. Compara.tive evaluation of serological tests in Indian kala-azar. J Trop Med Hyg. 1994; 97(6): 333–340.

Harith AE, Kolk AH, Leewenburg J, Muigai R, Huigen E, Jelsma T,et al. Improvement of a direct agglutination test for field studies of visceral leishmaniasis. J Clin Microbiol. 1988; 26(7): 1321–1325.

Mikaeili F, Fakhar M, Sarkari B, Motazedian MH, Hatam G. Comparison of serological methods (ELISA, DAT and IFA) for diagnosis of visceral leishmaniasis utilizing an endemic strain. Iranian Journal of Immunology. 2007; 4(2): 116-21.

De Colmenares M, Portus M, Riera C, Gallego M, Aisa MJ, Torras S, et al. Detection of 72–75 kD and 123 kD fractions of leishmania antigen in urine of patients with visceral leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg. 1995; 52(5):427–428.

Andresen K, Gasim S, Elhassan AM, Khalil EA, Barker DC, Theander TG, et al. Diagnosis of visceral leishmaniasis by polymerase chain reaction using blood, bone marrow and lymphnode samples from patients from the Sudan. Trop Med Int Health. 1997; 2(5): 440–444.